VIỆN KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM QUỐC GIA

 

 

Các hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm

1. Nguyên tắc

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

• Cấu tạo của hệ thống HPLC

Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ.

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.

Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 - 7µm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)

• Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó làcác silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH₂, -CN...), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluene…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực.
• Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C₁₈H₃₇, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril…Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

Pha động trong HPLC

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với tướng tĩnh

- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao

- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

- Không quá đắt

Một pha động phù hợp là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi góp phần tốt nhất có thể được vào phép tách. Phù hợp ở đây là phù hợp về độ phân cực, về detector cũng như các tính chất cần thiết khác như khả năng tạo phức.

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp.

Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược.

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS₂), chlorobutan, CCl₄, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp người ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là rửa giải gradient nồng độ.

Các loại detector trong HPLC

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS:  áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).

- Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp…

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến, như diot-aray, MS, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.

2. Ứng dụng các hệ thống HPLC tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm

Tại khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm hiện nay có > 5 thiết bị HPLC với các loại detector: UV-Vis, PDA, FLD, RI được phân loại và sử dụng chuyên biệt để phân tích các vi chất dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm như sau:

Các vi chất dinh dưỡng

+ Vitamin tan trong dầu: vitamin A (retinol, retinyl palmitate…), carotene (carotene tổng số, beta-caroten), vitamin D (D2, D3), vitamin E (alphatocopherol, tocopheryl acetat, beta-tocopherol, gama-tocopherol, delta-tocopherol), vitamin K3

+ Vitamin tan trong nước: vitamin nhóm B (B1, B2, B3, B5, B6, B9), vitamin C (acid ascorbic, ascorbyl palmitate, ascorbyl glucoside, ascorbyl phosphate).

+ Đường (glucose, fructose, saccarose, lactose…)

Các phụ gia thực phẩm

+ Nhóm chất bảo quản: acid bezoic và các muối benzoate, acid sorbic và các muối sorbat, BHA, BHT, TBHQ

+ Nhóm chất ngọt tổng hợp: aspartame, saccharin, acesulfam K, cyclamate…

+ Nhóm chất tạo ngọt năng lượng thấp: sorbitol, isomalt, maltitol, erythritol, xylitol, mannitol…

+ Nhóm chất ngọt tự nhiên: steviol glycosides

+ Nhóm phẩm màu tổng hợp: tartrazine, amaranth, sunset yellow, carmoisine, carmine, brilliant blue, fast green, erythrosine, ponceur 4R…

+ Nhóm phẩm màu tự nhiên: curcumin, riboflavin, anthocyanin…

+ Nhóm chất điều chỉnh độ acid: acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric, acid lactic, acid oxalic, acid citric…

+ Nhóm chất điều vị: mono natri glutamate, inosilate, gualynate…